Schleim

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21768 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Nacktschnecke Arion vulgaris hat als einer der schlimmsten invasiven Pflanzenfresserschädlinge in Europa große Aufmerksamkeit erregt und ist bekannt für den zähen Schleim, den sie zur Fortbewegung absondert. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf die Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, insbesondere Exosomen und exosomenähnlicher Vesikel, aus Arion-Sekreten. Wir haben eine Methode zur Sammlung von Schneckenschleim und anschließender Vesikelisolierung durch Ultrazentrifugation entwickelt. Die isolierten Vesikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 100 nm tragen reichlich Proteine ​​und kurze RNAs sowie Adhäsionsmoleküle, die den Galektinen von Säugetieren ähneln. Wir haben gezeigt, dass die extrazellulären Vesikel der Schnecke in In-vitro-Tests von Pflanzenzellen und menschlichen Krebszellen internalisiert werden und mit bioaktiven Verbindungen beladen werden können, was sie zu einem interessanten Werkzeug für den Einsatz in der Biotechnologie macht.

Spanische Wegschnecken (Arion vulgaris, Moquin-Tandon, 1855) sind die häufigste europäische Schneckenart und zählen zu den schlimmsten invasiven Schädlingen in Europa. Arion-Schnecken sind gefräßige Pflanzenfresser, von denen bekannt ist, dass sie erhebliche ökologische1,2,3,4,5 und wirtschaftliche Schäden6,7 verursachen. Darüber hinaus fungieren sie als Überträger für pathogene Bakterien und als Wirte für Parasiten, die Haustiere und Rinder schädigen8,9,10. Arion vulgaris produziert hochviskosen, klebrigen und schwer zu entfernenden ventralen Schleim, der hauptsächlich von fünf subepithelialen, lateral und ventral gelegenen Drüsentypen erzeugt wird, was es ihm ermöglicht, viele Arten von Oberflächen und natürliche sowie künstliche Hindernisse zu überwinden, die zum Erfolg ihrer geografischen Ausbreitung beitragen könnten und das Ausmaß des aktuellen Befalls in ganz Europa11,12,13.

In dieser Studie haben wir uns entschieden, nach extrazellulären Vesikeln, insbesondere Exosomen und Exosomen-ähnlichen Vesikeln (EXs), im Arion-Schleim zu suchen. EXs sind extrazelluläre Vesikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ~ 100 nm, die im endosomalen Kompartiment der meisten eukaryontischen Zellen erzeugt werden und ein großes Potenzial für biomedizinische Anwendungen haben (wie in 14,15 ausführlich besprochen). Zum Beispiel Doxorubicin (DOX, Adriamycin), isoliert aus Streptomyces sp. Es wird häufig als Erstlinientherapie für eine Vielzahl solider bösartiger Erkrankungen eingesetzt (1974 von der FDA zugelassen) und ist bekannt für seine dosisabhängige kardiale und schwere systemische Toxizität, die durch die Konjugation mit Exosomen aus menschlichen In-vitro-Zellen deutlich reduziert werden könnte Kulturen16.

Abgesehen davon, dass Säugetiere die traditionelle Quelle von EXs für die Forschung und neuere Therapien sind, erfreuen sich auch Nicht-Säugetier-Quellen von EXs aufgrund ihrer interessanten Eigenschaften und komplexen Rollen (die von Interaktionen zwischen Arten bis hin zur Kommunikation zwischen Königreichen reichen) in letzter Zeit zunehmender Beliebtheit17,18, 19,20,21,22. EXs aus verschiedenen Quellen wie Bienenprodukten, Schlangengift oder Pflanzen und Früchten werden zu einem immer attraktiveren Werkzeugkasten für die Agrar-, Pharma- und biomedizinische Industrie17,20,23,24. Inspiriert durch die Fortschritte in diesem Forschungsbereich (und durch die Verfügbarkeit der Arion-Schnecken für eine potenzielle groß angelegte EX-Isolierung) machten wir uns daran, den pestiziden Arion vulgaris als potenzielle alternative EX-Quelle für Anwendungen in der Biotechnologie zu untersuchen.

In dieser Studie haben wir eine einfache und effiziente Methode zur Sammlung von Schneckenschleim und anschließender EX-Isolierung durch Ultrazentrifugation bereitgestellt. Die Slug-EXs wurden durch Nanopartikelgrößenanalyse und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert und visualisiert, zusammen mit dem Größenverteilungsprofil, das durch die Technik der dynamischen Lichtstreuung bereitgestellt wurde. Der EXs-Proteingehalt wurde durch Bicinchoninsäure- und CBQCA-Proteinquantifizierungstests quantifiziert, eine RNA-Isolierung wurde durchgeführt und das Vorhandensein von Adhäsionsmolekülen wurde mittels Western Blot überprüft. Darüber hinaus wurde die Modellwirksamkeit der Wirkstoffbeladung der Schnecken-EXs zusammen mit der Zellaufnahme unter In-vitro-Bedingungen demonstriert.

Das Vorhandensein von EXs im von Arion vulgaris-Schnecken gesammelten Schleim wurde mithilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft, wie in (Abb. 1a – d) gezeigt. Die Konzentration der Schnecken-EXs im 100-fach verdünnten Isolat betrug 5,27 × 109 (± 6,65 × 107) Partikel/ml mit einem mittleren Durchmesser von 154,2 nm (± 43,4 nm), bestimmt durch NTA. Die EXs neigen dazu, Aggregate zu bilden, wie die Analyse einer Videoaufzeichnung der Teilchen zeigt, die sich unter der Brownschen Bewegung bewegen. Wie DLS zeigt, liegen 90 % der EXs in einem Größenbereich von 40–160 nm. Die TEM-Analyse bestätigte das Vorhandensein runder Vesikel mit verschiedenen Durchmessern im Bereich von 44 bis 160 nm.

Charakterisierung von Slug EXs. (a) Repräsentatives Histogramm, das die Nanopartikelgrößenverteilung von Schnecken-EXs in flüssiger Suspension veranschaulicht, wie durch Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt. (b) Visualisierung der einzelnen EXs (einzelne weiße Punkte unterschiedlicher Größe) und ihrer Aggregate (rote Pfeile) aus einer Videoaufzeichnung der Partikel, die sich unter der Brownschen Bewegung bewegen. (c) Repräsentatives Histogramm, das die Größenverteilung von Schnecken-EXs veranschaulicht, wie durch dynamische Lichtstreuungsanalyse bestimmt. (d) Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Slug-EXs, die vesikuläre Strukturen zeigen.

Die durchschnittliche Proteinkonzentration im Lysat der Nacktschnecken-EXs betrug laut BCA-Proteinassay 108,71 μg (± 4,79 μg) pro 1010 Partikel, verglichen mit dem durchschnittlichen Proteingehalt von 429,32 mg (± 210,49 mg) pro 1010 Partikel bei Quantifizierung mit dem CBQCA-Protein Assay (Abb. 2a). Da der BCA, eine der in der Literatur am häufigsten verwendeten Methoden zur Quantifizierung von Exosomen und deren Proteingehalt, fehlerhafte Werte liefern könnte, wenn häufige Membranlipide/Phospholipide vorhanden sind25,26, sollte die Kombination des NTA- und CBQCA-Proteinassays die bevorzugte Methode sein die Schnecken-EXs und ihre Proteinquantifizierung.

Inhaltsanalyse von Slug EXs. (a) Vergleich der EXs-Proteinkonzentrationen, die durch BCA- und CBQCA-Quantifizierungstests bereitgestellt werden. (b) RNA-Gehalt der Schnecken-EXs. (c) Aus den Schnecken-EXs isolierte RNA (Spur 3) im Vergleich zur Ladekontroll-siRNA (21mer-Duplex mit dTdT-Überhang, Sigma-Aldrich; Spur 2) und zur DNA-Leiter (unterste Bande = 250 bp; Spur 1). (d) Western-Blot-Analyse von Schnecken-EXs-Lysat unter Verwendung eines Galectin-1/LGALS1-Primärantikörpers gegen menschliches Galectin-1-Protein (für die nicht beschnittenen Western Blots und Gele siehe ergänzende Daten).

Die Schnecken-EXs enthielten 4,09 μg (± 0,91 μg) RNA pro 1010 Partikel (Abb. 2b). Der Hauptanteil der aus den Schnecken-EXs isolierten RNA bestand aus reichlich vorhandenen kurzen RNAs mit einer ungefähren Größe <250 Basen (Abb. 2c). Mittels Western Blot mit primären Antikörpern gegen exosomale Marker und Adhäsionsmoleküle – Lektine (Galectin-1, 3, 8, 9), von denen bekannt ist, dass sie in menschlichen EXs vorkommen – konnten wir eines der Schnecken-EXs-Proteine ​​als Galectin-1-ähnliches Protein identifizieren (Abb. 2d), wie durch die Bande mit einer Größe zwischen 14 und 15 kDa dargestellt.

Die Doxorubicin (DOX)-Beladungskapazität durch Slug-EXs wurde mittels Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert und bestätigte die erfolgreiche Aufnahme von 1,26 µg (± 0,59 µg) des Vorläuferions Doxorubicin pro 1010 Partikel. Die geschätzte EXs-Beladungseffizienz von etwa 2,5 % wurde durch Vergleich der anfänglichen Eintrittskonzentration von DOX mit der endgültigen DOX-EXs-Konzentration (100 µg/ml DOX vs. 2,5 ± 0,27 µg/ml DOX-EXs) nach der Co-Inkubation berechnet anschließende Waschschritte (Abb. 3a,b).

Slug EXs werden mit DOX geladen. (a) Nach der gemeinsamen Inkubation von DOX mit EXs für 2 Stunden bei 37 °C (1) wurden zwei aufeinanderfolgende Waschschritte durchgeführt, um das restliche ungebundene DOX zu entfernen. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 100.000 × g ultrazentrifugiert, der Überstand mit dem freien DOX wurde verworfen, das Pellet mit den Nanovesikeln mit PBS gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert und dieser Schritt zuvor wiederholt (2.–3.). Quantifizierung des EXs-gebundenen DOX mittels LC-MS/MS (4). (b) Resultierende Aufnahme des DOX pro 1010.

Der In-vitro-Zellinternalisierungstest von mit BODIPY TR Ceramide gefärbten Schnecken-EXs bestätigte die Aufnahme von EXs durch menschliche U87-Glioblastom- und BY-2-Pflanzenzellen, wie durch konfokale Mikroskopie-Bildgebung gezeigt (Abb. 4a, b). Nach der Internalisierung der gefärbten EXs war der Fluoreszenzfarbstoff im Zytoplasma sowohl menschlicher als auch pflanzlicher Zelllinien deutlich nachweisbar.

Slug EXs-Zellaufnahmetests. (a) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Analyse der menschlichen U87-Glioblastomzellen nach dem BODIPY TR Ceramide-gefärbten EXs-Aufnahmetest. Maßstabsbalken = 10 µm. (b) Konfokalmikroskopische Analyse der BY-2-Pflanzenzellen nach dem EXs-Aufnahmetest. Maßstabsbalken = 50 µm.

Schleim von Landschnecken (Schnecken) ist eine komplexe Substanz, die im Allgemeinen von Epidermisdrüsen abgesondert wird, die die äußere Oberfläche der Tiere bedecken, und verschiedene Funktionen und Eigenschaften hat (feuchtigkeitsspendend, schmierend, klebend, reparierend, schützend, abwehrend usw.)27, 28,29. Seine Zusammensetzung kann je nach Spezies und je nach Funktion variieren30,31, besteht aber im Allgemeinen zu über 90 % aus Wasser und einer Vielzahl von Proteoglykanen, Glykosaminoglykanen, Glykoproteinenzymen, Hyaluronsäure, Kupferpeptiden, antimikrobiellen, antimykotischen und antiviralen Peptiden31,32 und Metallionen33,34,35. Es ist bekannt, dass Schnecken, denen das schützende Gehäuse von Schnecken fehlt, einen extrem zähen Schleim absondern, wenn sie durch Raubtiere oder Menschen gefährdet oder gestört werden36,37,38.

Schnecken- und Nacktschneckensekrete erwiesen sich als äußerst vielversprechende Substanzen für den Einsatz in der Biomedizin und der Kosmetikindustrie sowie für industrielle Anwendungen12,39,40,41,42,43,44,45. Der Schleim enthält Proteine ​​wie Kollagen, Elastin, Glykolsäure (kann in die Haut eindringen und eine erhöhte Kollagensynthese bewirken46) und Allantoin (bekannt für seine Förderung der Wundheilung und Zellproliferation47,48). Schneckenschleim zeigt Potenzial zur Regeneration und Reparatur von Knochen und Zähnen49. Inspiriert durch diese Studien konzentrierten wir uns auf die Untersuchung des Arion-Schleims auf das Vorhandensein von EXs, von denen angenommen wurde, dass sie ein häufiger Bestandteil tierischer Sekrete sind18. Die isolierten Schnecken-EXs weisen eine Größenverteilung auf, die denen von Säugetieren/Menschen ähnelt, und tragen typische Ladungen wie Proteine ​​und kurze RNAs.

Die meiste Aufmerksamkeit im Bereich der EX-Forschung wurde auf menschliche (Säugetier-)EX-Quellen gerichtet, um ein grundlegendes Verständnis ihrer Rolle in biologischen Prozessen zu vermitteln und ihre potenzielle Verwendung in der Biomedizin zu untersuchen. Es besteht jedoch ein wachsendes Interesse an weniger konventionellen Quellen, die von Wirbellosen bis hin zu Pflanzen und Pilzen reichen17,50,51,52. EXs sind nicht nur auf die Kommunikation innerhalb eines Individuums oder innerhalb einer bestimmten Art beschränkt, sondern es wurde wiederholt gezeigt, dass sie Interaktionen sowohl zwischen Arten als auch zwischen Königreichen ermöglichen18. Abgesehen von ihrer wichtigen Rolle bei der Kommunikation von Zelle zu Zelle (als Vehikel für bestimmte Moleküle wie Proteine, Enzyme, Wachstumsfaktoren oder RNAs) wurde gezeigt, dass EXs einen allgemeinen Mechanismus zur Vermittlung der Kommunikation innerhalb von Wirt-Parasit-Interaktionen darstellen. Es ist bekannt, dass sie als Träger von Virulenzfaktoren und verschiedenen Effektorproteinen von Parasiten zu ihren Wirten fungieren. Folglich sind EXs für die Biomedizin von besonderem Interesse, da sie pathogene Reaktionen und Prozesse vermitteln und modulieren, indem sie die Genexpression des Wirts und die Reaktion des Immunsystems des Wirts verändern21. Dennoch hat eine Infektion (oder ein Befall im Fall von Nacktschnecken) eine bidirektionale Wirkung zwischen dem Parasiten und seinem Wirt, und EXs werden dementsprechend als Reaktion auf Parasiten produziert. Es wurde gezeigt, dass Pflanzen-EXs durch den Transport verschiedener Proteine ​​und kleiner RNAs an der Kommunikation zwischen Pflanzen und ihren Krankheitserregern beteiligt sind. Während der Pilzinfektion der Pflanze werden kleine RNAs wie miR166 und miR159 über Pflanzen-EXs in die Hyphen des Pilzes transportiert, wo sie die Expression von Virulenzenzymen regulieren53. Der Transport von Biomolekülen kann jedoch bidirektional erfolgen, da kleine RNAs des Pilzes auf pflanzliche Abwehrgene abzielen können54.

Unsere Daten stützen die Hypothese eines möglicherweise komplexen wechselseitigen Zusammenspiels der EXs in der Rolle von Reaktionsvermittlern zwischen dem Arion-Pflanzenfresser und seiner pflanzlichen Ernährung. Die Schnecken-EXs sind mit Proteinen und kurzen RNAs beladen und wurden unter In-vitro-Bedingungen nachweislich von Pflanzenzellen internalisiert (Abb. 4a, b). Es ist bekannt, dass Pflanzen auf Pflanzenfresser ähnlich wie auf Infektionen reagieren und dabei verschiedene biochemische und molekulare Mechanismen nutzen, um den fressenden Organismus anzugreifen. Einige der von Pflanzen erzeugten Verbindungen sind Abwehrstoffe, die die Prozesse der Nahrungsaufnahme, des Wachstums und des Überlebens der Pflanzenfresser beeinflussen55,56. Als Reaktion darauf könnte der gefräßige Arion vulgaris EXs nutzen, um die Stressreaktion der Pflanze zu seinen Gunsten zu verändern. Eine weitere mögliche Rolle von Schnecken-EXs ist der Schutz der Schnecken vor einer Infektion durch Bakterien oder Viren sowie vor ihren potenziellen Feinden oder die Vermittlung der Kommunikation mit anderen Arion-Schnecken oder Landschnecken über die Schleimspuren29,57,58,59,60. Das Potenzial von Schnecken-EXs als Werkzeug zur Pflanzenmodifikation in der Pflanzenbiotechnologie oder als Werkzeug zur Schädlingsbekämpfung von Schnecken in der Landwirtschaft könnte eine Untersuchung wert sein.

Die EXs erfreuen sich im Bereich der Biomedizin immer größerer Beliebtheit. Die meisten der laufenden, auf Exosomen ausgerichteten klinischen Studien konzentrieren sich auf EX menschlichen Ursprungs als diagnostische oder prognostische Biomarker (z. B. für viele Krebsarten). Mehrere Studien konzentrieren sich jedoch bereits auf den Einsatz von EXs als Therapeutika bei verschiedenen Arten von Krankheiten (wie kürzlich in61 besprochen). EXs als Werkzeug für Anwendungen zur Zellabgabe weisen im Vergleich zu viralen Vektoren eine verringerte Immunogenität, Stabilität im Blutkreislauf und ein erhöhtes Absorptionspotenzial im Vergleich zu Liposomen auf und sind in der Lage, physiologische Barrieren (z. B. Blut-Hirn-Schranke) zu überwinden62. Da der Arbeitsablauf für die Charakterisierung menschlicher EXs in unserem Labor bereits etabliert war (d. h. eine Reihe von Antikörpern gegen exosomale Adhäsionsmoleküle und Marker menschlichen Ursprungs), haben wir uns entschieden, unseren Satz primärer Antikörper gegen menschliche exosomale Adhäsionsmoleküle (Lektine) für die Suche nach verwandten zu verwenden Moleküle in den Schnecken-EXs. Das positive Signal für den menschlichen Galectin-1-Antikörper in den Schnecken-EXs zeigte das Vorhandensein menschlicher Galectin-1-ähnlicher Proteine. Galectine sind eine Familie löslicher, nicht glykosylierter Lektine mit kleinem Molekulargewicht zwischen 14 und 39 kDa, die an Galactose- und N-Acetyllactosamin-basierte Motive binden, die in allen Spezies weit verbreitet sind und mit der Aufnahme von Exosomen durch Zielzellen in Verbindung gebracht werden63,64 . Beim Menschen bindet Galectin-1 an die Oberfläche von Exosomen, die aus mesenchymalen Stromazellen der Plazenta, Tumor- oder Synzytiotrophoblastenzellen stammen, und ist an der Exosomenadhäsion beteiligt65,66,67. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Aufnahme von mit Galectin-1 angereicherten EXs durch menschliche Krebszellen zu einer Hochregulierung ihrer intrazellulären Konzentration führt, was die Migration von Krebszellen stark beeinflusst68. Nach unseren Daten (Abb. 2d) ist in den Schnecken-EXs ein Galectin-1-ähnliches Protein vorhanden, das möglicherweise eine analoge Funktion bei der Adhäsion und Aufnahme von EXs hat, was darauf hindeutet, dass Schnecken-EXs tatsächlich als effizientes Vehikel für bioaktive Moleküle in den Menschen dienen könnten Krebszellen in zellabgabebasierten Therapien.

DOX ist eines der am häufigsten eingesetzten Kanzerostatika zur Behandlung einer Vielzahl von Krebsarten. Es induziert den Zelltod durch mehrere intrazelluläre Ziele: Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies, Bildung von DNA-Addukten, Hemmung der Topoisomerase II, Histonentfernung oder Regulierung der Ca2+- und Eisenhomöostase16. Einer der zahlreichen Nachteile von DOX ist seine dosisabhängige kardiale und schwere systemische Toxizität69. Es hat sich gezeigt, dass die Einkapselung von DOX in nanoskalige Partikel-Arzneimittelverabreichungssysteme eine vorteilhafte Bioverteilung, Pharmakokinetik und kontrollierte Freisetzung bietet und gleichzeitig die systemische Toxizität senkt70. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden mehrere auf Nanotechnologie basierende DOX-Konjugationssysteme entwickelt, von denen einige die FDA-Zulassung erhalten haben16. Exosomen sind insbesondere für ihre Fähigkeit bekannt, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden und in bestimmte Gehirnzellen (z. B. Gliomzellen) internalisiert zu werden. Es wurde gezeigt, dass die Abgabe von DOX an Glioblastomzellen über Exosomen das Tumorwachstum in einem Zebrafischmodell erheblich hemmt71.

In Exosomen-Beladungsexperimenten wurden mehrere Beladungsmethoden verwendet, wobei die direkte Co-Inkubation aufgrund ihrer Einfachheit und des Fehlens nennenswerter Auswirkungen auf die Struktur und den Inhalt von Exosomen das am häufigsten untersuchte Verfahren ist72. Lösliche Substanzen wie DOX können nach der Zentrifugation nicht ausgefällt werden und können im Überstand der Ultrazentrifuge verworfen werden71,73. Daher ist die gängigste Strategie zur Isolierung von restlichem freien DOX aus beladenen EXs die zentrifugationsbasierte Trennung72. In diesem Zusammenhang haben wir ein einfaches Proof-of-Concept-Experiment durchgeführt, um das Potenzial der Slug-EXs für Zellabgabeanwendungen zu überprüfen, und haben gezeigt, dass Slug-EXs durch bioaktive Verbindungen beladbar sind, was durch einen DOX-Beladungstest durch passive Ladungsbeladung bestätigt wurde (direkte Co-Inkubation von EXs mit DOX). Die relativ geringe Beladungskapazität von Slug-EXs (ca. 2,5 %) würde für den Einsatz in Humantherapien ausreichen, die Wirksamkeit könnte jedoch durch die Verwendung aktiver Ladungsbeladungsansätze (z. B. Elektroporation oder Ultraschallbehandlung) erheblich gesteigert werden.

Schließlich wurde durch konfokale Mikroskopie (Abb. 4a, b) gezeigt, dass die Schnecken-EXs von menschlichen Glioblastomzellen internalisiert werden, die als In-vitro-Modell-Zellabgabesystem für EXs aus herkömmlichen Quellen dienen74.

Bisher sind menschliche mesenchymale Stammzellen oder menschliche dendritische Zellen die Hauptquellen für therapeutische EXs75. Die Kultivierung dieser Zellkulturen unter In-vitro-Bedingungen in ausreichenden Mengen für die EX-Ernte ist mühsam und wirtschaftlich anspruchsvoll (z. B. Verbrauch hochwertiger Zellkulturmedien), was die Suche nach günstigeren und reichlich verfügbaren Alternativen äußerst attraktiv macht. Zusammen mit den geringen Anforderungen an die Kultivierung der Arion-Schnecken unter Laborbedingungen könnte der enorme ökologische und wirtschaftliche Schaden, den dieser „Superschurke“ verursacht, zumindest teilweise durch die Bereitstellung eines interessanten Werkzeugs für Biotechnologie und Biomedizin in naher Zukunft ausgeglichen werden.

2 kg Arion-Schnecken wurden in den Sommersaisons 2021 und 2022 in Privatgärten im Nordwesten Böhmens (Tschechische Republik) gesammelt. Vor der Schleimsammlung wurden die Schnecken in mit Gartenerde und Holzabfällen gefüllten Plastikkäfigen oder Glasaquarien gehalten und mindestens 48 Stunden lang nach Belieben mit frischem grünem Salat und gehackten Gurken gefüttert, um sich vollständig an die künstlichen Laborbedingungen anzupassen. Nach der Schleimsammlung wurden die Schnecken wieder in ihren natürlichen Lebensraum entlassen. Die Artenbestimmung wurde von der Abteilung für Biologie der Jan-Evangelista-Purkyně-Universität in Ústí und Labem durchgeführt.

Vor der Schleimsammlung wurde jede Schnecke gründlich unter Leitungswasser abgespült, um die anhaftenden Rückstände und Fäkalien zu entfernen, gefolgt von einer kurzen Spülung mit entionisiertem Wasser. 250–300 g gespülte Schnecken (20–25 Individuen) wurden in 600-ml-Becher überführt, die mit 50 ml 0,01 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung + 0,0027 M KCl + 0,137 M NaCl pH 7,4 (PBS) gefüllt waren (Schleimlösung aus zwei Bechern gesammelt). wurde für nachfolgende Schritte gepoolt) oder 600–750 g Schnecken (ungefähr 50 Individuen) wurden in einen 2-l-Glasbehälter gefüllt mit 100 ml PBS überführt (Abb. 5f, g). Es wurden nur ausgewachsene und voll aktive Tiere im Gewichtsbereich von 12–15 g verwendet. Nach dem Transfer wurden die Slugs 10 Minuten lang vorsichtig manuell im Puffer geschüttelt und aus dem Behälter kriechen gelassen, wobei die Schleimlösung am Boden des Behälters zurückblieb. Anschließend wurden die Schnecken mit Leitungswasser gespült, in ihre Behälter zurückgelegt, gefüttert und zur Erholung gelassen. Die erhaltene Schleimlösung wurde mit zusätzlichem PBS auf ein Gesamtvolumen von 0,5 l verdünnt und 24 Stunden lang bei 4 °C auf dem Wippschüttler geschüttelt. Die Schleimlösung wurde dann unter Verwendung einer Reihe von 3 Küchensieben (Zpts Kolbiarz) mit abnehmender Maschenweite (X = 1 × 1 mm, Y = 0,75 × 0,75 mm, Z = dicht gewebte Filamente; Abb. 5a, e) filtriert. um den steifen und unlöslichen Anteil des Schleims zu entfernen, der innerhalb weniger Minuten nach der Entnahme eine starre, schaumige Kappe auf der Oberseite der Schleimlösung bildet (Abb. 5b–d). Nach dem Filtrieren durch die Küchensiebe wurde nur die vollständig verflüssigte Fraktion zur Zentrifugation gesammelt.

Verfahren zur Schleimsammlung. (a) Handelsübliche Küchensiebe mit abnehmender Maschenweite (X = 1 × 1 mm, Y = 0,75 × 0,75 mm, Z = dicht gewebte Filamente) wurden verwendet, um den steifen und unlöslichen Anteil des Schleims zu filtern. (b) Anteil des nach der Filtration mit X verbleibenden Schleims; Y = (c); Z = (d). (e) Detail der Z-Netzfilamente unter dem Mikroskop (jedoch könnte jedes Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 × 0,5 mm bis hin zu 0,2 × 0,2 mm ebenso effektiv verwendet werden). (f,g) Nach der Inkubation der Schnecken im PBS-Puffer kriechen die Schnecken spontan aus den zu sammelnden Behältern, spülen sie vorsichtig mit Leitungswasser ab und lassen sie sich erholen.

Die Differentialzentrifugation wurde auf einem Avanti JXN-26 durchgeführt, der mit einem Festwinkelrotor JLA 9, 1000 (Beckman Coulter) ausgestattet war. Zuerst wurde die Schleimlösung 20 Minuten lang bei 4 °C und 2000 × g zentrifugiert und der Überstand in eine saubere 500-ml-Zentrifugenflasche überführt. Anschließend wurde die Lösung 30 Minuten bei 4 °C und 10.000 × g und weitere 60 Minuten bei 15.000 × g und 4 °C zentrifugiert. Diese EXs-Lösung wurde durch einen hydrophilen Nylonnetzfilter mit einer Porengröße von 30 μm (Merck) filtriert. Im letzten Schritt wurden die EXs durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für 2 Stunden bei 4 °C (Optima XPN-90, Ausschwingrotor SW32Ti, Beckman Coulter) aus der Lösung isoliert. Das Pellet wurde in einem frischen PBS-Puffer resuspendiert und dieser Schritt wiederholt. Das endgültige Isolat wurde in 1 ml PBS mit einem vollständigen Inhibitorcocktail (Roche) und 5 μM Marimastat (Sigma-Aldrich) resuspendiert und zur weiteren Verwendung bei –20 ° C gelagert.

Die Größe der isolierten Vesikel wurde durch die DLS-Analyse unter Verwendung des Zetasizer Nano-ZS-Instruments charakterisiert, das mit einem 633-nm-He-Ne-Laser und einem mit einem Detektionswinkel von 173° positionierten Detektor (ZEN3600, Malvern Instruments) ausgestattet war. Proben mit einem konstanten Volumen von 120 μl wurden bei einer kontrollierten Temperatur von 25 °C und einem angenommenen Brechungsfaktor von 1,331 in Einweg-Mikroküvetten aus Kunststoff (ZEN0040, Malvern Panalytical) gemessen. Die Daten wurden mit der Malvern Panalytical-Software analysiert.

Vesikelgröße und -konzentration wurden von NTA unter Verwendung von NanoSight NS3000 (Malvern Instruments) analysiert. Die Datenerfassung und -analyse wurde mit der NTA-Software durchgeführt. Proben von etwa 300 μl wurden in die obere Plattenkammer der Durchflusszelle geladen. Die Kammer wurde von unten mit dem 405-nm-Laserstrahl beleuchtet, was zur Lichtstreuung durch die Partikel in der Probenlösung führte. Jede Probe wurde dreimal 60 Sekunden lang analysiert.

TEM wurde mit Wolframfilament (HT7820 Hitachi) durchgeführt. Für die Bildgebung wurden isolierte gefrorene EXs (Lagerung bei –20 °C) aufgetaut, (1:1) mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) (Gew./Vol.) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (PB), pH 7,4, gemischt und darin inkubiert Über Nacht im Kühlschrank (4 °C) aufbewahren. 5 µl Probentropfen wurden auf Parafilm aufgetragen und 200-Mesh-Formvar/Kohlenstoff-Gitter (Merck) wurden auf die Tropfen gelegt und 30 Minuten lang inkubiert. Die Gitter wurden dann 1 Minute lang auf Tropfen (100 µl) PB und dann 5 Minuten lang auf Tropfen (20 µl) 1 % Glutaraldehyd (GA) in PB übertragen. Die Gitter wurden 2 Minuten lang achtmal mit Tropfen (100 µl) entionisiertem Wasser gewaschen. Abschließend wurden die Proben 3–5 Minuten lang auf den Tropfen (100 µl) der UranyLess-Färbung gefärbt. Der Rest von UranyLess auf den TEM-Gittern wurde mit Filterpapier abgetupft und die Gitter 1 Stunde lang an der Luft trocknen gelassen. Die Proben wurden im Kontrastmodus beobachtet, wobei die beschleunigte Spannung auf 100 kV und der Strahlstrom auf 10 µA eingestellt waren. Die aufgenommenen Bilder wurden mit der Bitmap-Grafiksoftware Gimp verarbeitet.

Die Quantifizierung des exosomalen Proteins wurde mit dem BCA-Protein-Assay-Kit (Merck) und dem CBQCA-Protein-Quantifizierungs-Assay-Kit (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. Für den BCA-Assay wurden 25 μl jeder Probe mit 200 μl Arbeitsreagenz gemischt und anschließend 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. EXs-Lysate wurden analysiert, wobei 20 μl jeder Probe, 5 μl RIPA 5× und 200 μl Arbeitsreagenz verwendet und 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt wurden. Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung hergestellt. Eine Standardkurve (0–2000 μg/ml) wurde aus sechs seriellen Verdünnungspunkten von Rinderserumalbumin (BSA) und Arbeitsreagenz erstellt und 30 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. Der CBQCA-Proteinquantifizierungstest wurde gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt, wobei 1 × PBS anstelle des 0,1 M Natriumboratpuffers verwendet wurde. Die Absorption (bei 562 nm für den BCA-Assay) und die Fluoreszenz (Anregung 465 nm, Emission 550 nm für den CBQCA-Assay) wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung des GloMax Discover Microplate Reader (Promega) gemessen. Die Daten wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software) analysiert.

Für die exosomale RNA-Isolierung wurde das exoRNeasy Midi Kit (Qiagen) verwendet. 500 µl isolierte EXs in PBS wurden mit 1 ml Lysatpuffer gemischt und gemäß dem Protokoll des Herstellers verarbeitet. Die isolierte RNA wurde mit 2× RNA Gel Loading Dye (Life Technologies) gemischt und durch Gelelektrophorese unter Verwendung von 1 % Agarosegel in 1× TBE-Puffer (0,13 M Tris, 45 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA) analysiert, gefärbt mit 10.000× Verdünnung GelGreen-Nukleinsäurefärbung (Labmark) und aufgezeichnet mit dem G:BOX Gel-Doc-System (Syngene). Als Ladekontrolle wurde siRNA 21mer-Duplex mit dTdT-Überhang (Sigma-Aldrich) verwendet. Die Konzentration wurde mit einem Spektrophotometer DS-11 FX (DeNovix) gemessen. Die Daten wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software) analysiert.

Western Blot wurde verwendet, um das Vorhandensein von Exosomenmarkern (Adhäsionsproteinen) in den Schnecken-EXs zu überprüfen. Zur Lyse von Exosomenproben wurde ein Lysepuffer bestehend aus RIPA 1X, Mercaptoethanol 5 % und 5 mM PMSF verwendet. Die Proben wurden 30 Minuten lang bei 4 °C mit Lysepuffer inkubiert und anschließend der SDS-PAGE auf einem 12 %igen Polyacrylamidgel unterzogen. Proteine ​​wurden auf die Nitrozellulosemembran geblottet. Als Blockierungsmittel und zur Antikörperverdünnung wurde 5 % Milch in TBST verwendet. Die Membran wurde mit dem primären Antikörper (500-fach verdünnt in 5 % Milch in TBST) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurde die Membran sechsmal in TBST gewaschen und mit dem Sekundärantikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die gewaschene Membran wurde in SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) inkubiert und sichtbar gemacht. Verwendete Primärantikörper: Galectin-1/LGALS1-Antikörper, Galectin-3/LGALS3 (D4I2R) XP Rabbit mAb, rekombinanter Anti-Galectin 8/Gal-8-Antikörper (Abcam) und Galectin-9 (D9R4A) XP Rabbit mAb. Sekundärantikörper: Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper. Alle Antikörper außer Galectin-8 wurden von Cell Signaling Technology erworben.

Das Verfahren zum Laden von EXs durch DOX wurde von 71 übernommen und wie folgt modifiziert (Abb. 3). Die 5 μl DOX-Lösung (1000 μg/ml) wurden zu 50 μl Exosomen (300 μg/ml Gesamtproteine, gemessen durch BCA) in PBS gegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Um die DOX-Aufnahme durch die Exosomen zu bestimmen, wurde die Mischung 30 Minuten lang bei 100.000 × g ultrazentrifugiert, der Überstand mit dem freien DOX wurde verworfen und die EXs wurden gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt, um das restliche freie DOX effektiv zu entfernen (Abb. 3). Die DOX-Konzentration in den EXs wurde mittels LC-MS/MS bestimmt.

Für die LC-MS/MS-Analyse wurde die Trennung mit einem Agilent 1290 Infinity II UHPLC-System (Agilent Technologies) mit einer Kinetex Polar C18 Analysesäule 2,1 × 150 mm, 2,6 µm (Phenomenex) bei einer Flussrate von 0,4 ml/ durchgeführt. Mindest. Die mobilen Phasen bestanden aus (A) H2O mit 0,1 % HCOOH und (B) Acetonitril mit 0,1 % HCOOH. Das HPLC-System war an ein Agilent G6495A Triple Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt, das mit einer Agilent Jet Stream-Elektrospray-Ionisationsquelle ausgestattet war. Standardkurven der Signalantwort gegenüber der Konzentration für die Quantifizierung von DOX wurden durch Auftragen der Signalantwort im Bereich von 0–10 µg/l DOX in PBS erstellt. Der Einfluss der Matrix auf die DOX-Bestimmung wurde durch Dotierung jeder Probe mit 1 µg/l DOX überprüft.

Die menschliche Glioblastom-Zelllinie U87 (ATCC) wurde in vollständigem Eagle-Minimalmedium gehalten, das mit 100 mM nicht-essentieller Aminosäuren (NEAA), 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin, 100 µl Penicillin und 0,1 mg Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) ergänzt war. . Die Zellen wurden bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert.

Die Tobacco Bright Yellow-2 (BY-2)-Suspensionskultur von Nicotiana tabacum wurde vom Institut für experimentelle Botanik der Tschechischen Akademie der Wissenschaften bereitgestellt. Die Zellen wurden in Erlenmeyerkolben im Dunkeln bei 26 °C auf einem Schüttler (105 U/min) kultiviert. Die Medien wurden unter Verwendung von 4,3 g/l Murashige-Skoog-Basalsalz hergestellt; 30 g/l Saccharose; 0,2 g/l KH2PO4; 0,1 g/l Inosit; 1 mg/l Thiamin und 0,2 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure. Der pH-Wert des Mediums wurde auf 5,6–5,8 eingestellt und es wurde 20 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 °C sterilisiert. BY-2-Zellen für Experimente wurden eine Woche nach ihrer Übertragung in frische Medien gesammelt.

Wir führten einen EXs-Internalisierungstest durch, um die zelluläre Aufnahme von Schnecken-EXs zu bewerten. U87-Zellen (menschliches Glioblastom) und BY-2-Zellen (Pflanze) wurden 4 Stunden lang mit BODIPY TR Ceramide (Thermo Fisher Scientific) gefärbten EXs inkubiert. 1 × 108 EXs in 100 µl PBS wurden mit 2 µl BODIPY TR Ceramide gemäß dem Datenblatt des Anbieters inkubiert. Anschließend wurden die markierten EXs durch Exosomen-Spin-Säulen gereinigt und mit Zellen inkubiert. Als Negativkontrolle dienten unbehandelte Zellen. Die Aufnahme von EXs wurde mit einem HC PL APO CS2 20 × 0,75 DRY-Objektiv des CLSM SP8-Mikroskops (Leica) mit 488 nm Anregung und 650–750 nm Emission (roter Kanal) bewertet.

Die Jan-Evangelista-Purkyně-Universität ist eine zertifizierte Einrichtung für die Verwendung von Tieren in der Forschung (veterinärmedizinische Zulassungsnummer CZ 42760032, Zulassungsnummer des Landwirtschaftsministeriums der Tschechischen Republik MZE-19331/2022-13143). ML, OJ sind für die Planung und Durchführung von Tierversuchen zertifiziert (Zertifikatsnummern: ML-CZ 03236, OJ-CZ 02834). Bei den Versuchsdurchgängen (Schleimsammlung) wurden keine Tiere geschädigt.

Alle Rohdaten und Original-Western-Blot-Bilder sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde von der Internen Förderagentur der Jan-Evangelista-Purkyně-Universität in Ústí nad Labem (Nr. 5322116201301) und von der SGS der Fakultät für Naturwissenschaften (Nr. 5322715200101) unterstützt; durch das Projekt der Tschechischen Wissenschaftsstiftung (Nr. 20-21421S), durch die Europäischen Struktur- und Investitionsfonds im Rahmen des Operationellen Programms Forschung, Entwicklung und Bildung – das EFRE/ESF-Projekt „UniQSurf – Zentrum für Bioschnittstellen und hybride Funktionsmaterialien“ ( Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/17_048/0007411), die Forschungsinfrastruktur NanoEnviCz (Projekt Nr. LM2018124) und Pro-NanoEnviCz (Reg. Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001821 und CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015586).

Zentrum für Nanomaterialien und Biotechnologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Jan-Evangelista-Purkyně-Universität in Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, Tschechische Republik

Michaela Liegertová, Alena Semerádtová, Michaela Kocholatá, Michaela Průšová, Marcel Štofik, Jan Malý & Olga Janoušková

Fachbereich Biologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Jan-Evangelista-Purkyně-Universität in Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, Tschechische Republik

Michaela Liegertová & Lenka Němcová

Abteilung für Umweltchemie und -technologie, Fakultät für Umwelt, Jan-Evangelista-Purkyně-Universität in Ústí nad Labem, Ústí nad Labem, Tschechische Republik

Sylvie Kříženecká

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Schneckensammlung: ML, AS, LN; Schleimansammlung: ML, AS; Exosomenisolierung und DLS: AS, ML; RNA-Isolierung und -Analyse: MP, ML; NTA und BCA: MK, MP; Western Blot: MK, OJ, AS; TEM: MS; DOX-Beladung und konfokale Bildgebung: OJ; LC–MS/MS: SK; Zellinternalisierungstests: OJ, MK; Datenanalysen und Manuskriptkorrekturen: JM, OJ; Manuskripterstellung, Fotos (Abb. 5) und Schema (Abb. 3) Autorschaft: ML

Korrespondenz mit Michaela Liegertová.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Liegertová, M., Semerádtová, A., Kocholatá, M. et al. Von Schleim abgeleitete exosomenähnliche Vesikel der Spanischen Wegschnecke (Arion vulgaris): Nutzung invasiver Schädlingsarten in der Biotechnologie. Sci Rep 12, 21768 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26335-3

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Eingegangen: 30. August 2022

Angenommen: 13. Dezember 2022

Veröffentlicht: 16. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26335-3

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